HPLC或GC鉴别中，要求样品与对照品保留时间“一致”，这个“一致”怎么理解？差多少算一致

2026-01-02

HPLC或GC鉴别中，要求样品与对照品保留时间“一致”，这个“一致”怎么理解？差多少算一致

在2025年11月4日举行的ECA在线培训“HPLC方法的系统适用性测试与故障排除”期间，与会者提出了一个问题：
Q：for example, a retention time of 2.0 min ± 0.2 min can be defined, corresponding to a 10% variation in retention time. Would it therefore be acceptable to perform an HPLC identification test with a maximum 10% difference in retention time between the sample and the working standard? If yes, which guideline is applicable?
A：There is no guideline in place which describes the variability of the retention time, e.g. for identification tests. The example is an approach and the variability should be justified in a rationale (or even ATP).
问：例如，可以定义保留时间为2.0分钟±0.2分钟，这对应于保留时间10%的变异。那么，在进行HPLC鉴别试验时，样品与工作标准品的保留时间最大差异为10%是否可以接受？如果可以，适用哪项指南？
答：目前没有指南描述保留时间的变异性，例如用于鉴别试验。所举的例子是一种处理方式，这种变异性应在一个理论依据（甚至ATP）中进行合理性论证。
这里的回答怎么理解？怎样在理论依据（甚至ATP）中进行合理性论证？
我是这么理解的：

一、关于“10%保留时间变异”的来源与适用性

培训中提到的例子（如2.0 min ± 0.2 min = ±10%）是一种经验性做法，并非来自强制性法规或国际指南（如ICH、USP、EP、JP等）的硬性规定。
目前主流药典和ICH指南（如ICH Q2(R2)、USP <621> Chromatography、EP 2.2.46）：
  • 未明确规定用于鉴别试验的保留时间允许偏差的具体百分比。
  • 通常要求：样品与对照品应在相同色谱条件下运行，其保留时间应“一致”或“相符”（co-elute 或 correspond）。
  • 强调系统适用性（System Suitability）的重要性，包括保留时间的重现性（RSD通常要求<1%）。
因此，±10%本身不是普遍接受的标准，尤其在高精密度的现代HPLC系统中，10%的偏差（如2.0 min → 2.2 min）可能过大，暗示系统存在异常（如流速不准、柱温波动、流动相比例错误等）。

二、为何不能直接采用“10%”作为通用接受标准？

  • 保留时间对色谱条件高度敏感：
  • 温度变化1°C → RT变化约1–2%
  • 流速误差1% → RT变化约1%
  • 柱效下降或批次差异也可能影响RT
  • 鉴别试验的核心是特异性：
  • 仅靠保留时间匹配不足以确证身份（需结合DAD光谱、MS等）
  • 若RT漂移过大，可能与其他杂质共流出，导致误判
  • 现代HPLC系统的重现性远优于10%：
  • 正常条件下RT RSD应<1%，故±10%显然过于宽松

三、如何在理论依据或ATP中进行合理性论证？

若因特定原因（如老旧设备、复杂基质、梯度方法等）需设定较宽的RT接受标准（如±5%或极端情况下±10%），应在方法开发/验证文件中提供科学论证，包括但不限于：

1. 基于ATP定义鉴别要求

在ATP中明确：
“鉴别试验应能区分目标分析物与潜在干扰物，在预期操作条件下，保留时间窗口应足以覆盖正常系统波动，同时确保特异性。”

2. 实验数据支持

  • 进行稳健性研究（Robustness Study）：
  • 考察不同流速（±5%）、柱温（±2°C）、流动相比例（±2%）等对RT的影响
  • 证明在最差条件下，目标峰仍能与邻近峰基线分离，且RT变化在所提议窗口内
  • 提供历史数据或多批次验证数据，显示RT自然变异范围（如n=20次进样，RT = 2.00 ± 0.05 min → RSD=2.5%）

3. 风险评估

  • 说明若采用±10%是否会导致：
  • 与已知杂质/降解产物共流出？
  • 降低方法特异性？
  • 影响批次放行决策？
  • 若风险可控（如无相近保留杂质、有DAD确认），可接受较宽窗口

4. 引用内部SOP或行业实践

  • 虽然药典无具体数值，但某些企业SOP或行业白皮书（如Pharmaceutical Quality System）可能允许基于风险设定RT窗口
  • 可参考FDA的Quality by Design（QbD）理念：接受标准应基于对方法性能的理解

5. 明确写入方法文件

在SOP或分析方法中注明：
“样品主峰保留时间应与同期运行的工作标准品保留时间相差不超过±X%（例如±2%），该限值基于方法验证中的系统重现性和稳健性数据确定。”

四、建议的实践做法

场景

建议RT接受标准

常规等度HPLC鉴别

±1–2% 或 ±0.1 min（取更严者）

复杂梯度方法

±2–3%，需验证

特殊情况（如生物基质）

可放宽，但需ATP+验证+风险评估支持

避免直接使用±10%

除非有极强证据支持


五、总结

  • ±10%保留时间差异通常不可接受用于HPLC鉴别试验，因其远超正常系统变异。
  • 无指南直接规定RT允许偏差，但要求“一致”或“相符”，需通过系统适用性和方法验证确保。
  • 若需设定特定RT窗口，必须在ATP或方法验证报告中提供：
  • 实验数据（重现性、稳健性）
  • 风险评估（特异性、分离度）
  • 科学理由（设备限制、方法特性等）
✅ 最佳实践：将保留时间作为辅助鉴别参数，结合光谱一致性（如DAD相似度>990）或质谱信息，构建多重确认策略，而非依赖单一RT窗口


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